Andres E. Carrasco
Laboratorio Embriología Molecular
Efecto del glifosato en el desarrollo embrionario de Xenopus laevis
(Teratogénesis y glifosato)
Informe preliminar
PRESENTACION
El presente trabajo fue realizado en el Laboratorio de Embriología
Molecular CONICET-UBA sito en la Facultad de Medicina.
Los embriones de anfibios de la especie Xenopus laevis son un modelo
tradicional para el estudio del desarrollo embriológico y constituyen
el que mejor se presta para analizar las alteraciones de cualquier
tipo en las etapas más tempranas del desarrollo embrionario, a
diferencia de los modelos experimentales pollo y ratón, que no
permiten estudiar de la misma manera los efectos de moléculas o
fármacos.
Este modelo experimental, al igual que los otros mencionados, es
adecuado para inferir posibles alteraciones y síndromes por defectos
del desarrollo anotados en la descripción médica. Esto se debe a que
el grupo de los vertebrados comparten una sorprendente conservación de
los mecanismos genéticos que regulan el desarrollo embrionario y por
lo tanto en gran medida conceptualmente homologables a la formación
del embrión humano al punto que la investigación y determinación de
estos mecanismos ha servido para comenzar a comprender determinados
síndromes descriptos en la clínica.
Por ello en este momento es parte del proyecto sobre los efectos del
glifosato en la mecánica del desarrollo embrionario incorporar el
estudio de otros modelos de desarrollo.
El suscripto ha trabajado en embriología molecular desde 1981, siendo
una de las contribuciones más importantes el descubrimiento y
caracterizació n de los genes Hox en vertebrados en 1984.
La idea original de usar nuestra experiencia en mecanismos que
controlan el desarrollo embrionario temprano y aportar una base
experimental sobre los efectos del glifosato puro y del herbicida que
lo contiene, en embriones de Xenopus laevis surge hace aproximadamente
dos años a raíz de experiencias, contactos, y viajes personales a
distintos lugares del país y la falta de datos experimentales, al
menos en mi conocimiento, de evidencias sobre alteraciones producidas
por el glifosato sobre el desarrollo embrionario de vertebrados
durante las criticas etapas tempranas y en condiciones experimentales
controladas.
Uno de los mejores reportes sobre los efectos del glifosato en células
embrionarias en cultivos, fue realizado por el grupo de J. Seralini
(2005, 2007 y 2009). Otro aporte importante sobre los efectos
deldesarrollo embrionario del erizo de mar fue reportado por Marc J.
et al, Toxicol. Appl. Pharmacology 203 (1), 2005)
Cabria agregar que existieron otros hechos para iniciar esta investigación:
• Los reportes médicos sobre malformaciones de San Cristóbal y
Malabrigo, Prov. De Santa Fe con índices de 12 malformaciones sobre
cada 250 nacimientos, reportados por el Dr. Rodolfo Paramo.
• Otros ejemplos similares en Monte Cristo, Córdoba; Las Petacas,
Santa Fe; Ituzango,Córdoba.
• El reporte de Horacio Lucero Jefe del Laboratorio de Biología
Molecular del IMR, Chaco.
• El pedido de la Cámara de Diputados de Santa Fe al Poder Ejecutivo
de la Provincia para que SENASA recategorizara al glifosato como de
alta peligrosidad clase I.
• La clasificación de altamente toxico de la Northwest Coalition for
Alternative to Pesticides, entre otros.
Esta comunicación tiene como función reportar los resultados generados
hasta el presente. La necesaria profundizació n de los mismos será
conducida por el suscripto con el fin de comprender con mayor
profundidad los mecanismos involucrados y la mecánica de las
alteraciones observadas. La comunicación preliminar lleva sus
interpretaciones e hipótesis en base a los resultados obtenidos hasta
el momento.
Efecto del glifosato en el desarrollo embrionario de Xenopus laevis
INTRODUCCION
Los herbicidas y sus componentes
Una semilla transgénica es un desarrollo tecnológico que forma parte
de un paquete tecnológico, inseparable del herbicida al que está
asociada. En esta lógica siempre el herbicida en cuestión, sirve para
seleccionar una planta modificada genéticamente para que sea
resistente al mismo y que al mismo tiempo destruya las que no lo son.
Por lo tanto estos experimentos fueron dirigidos a estudiar los
efectos que pudieren producir en el desarrollo de vertebrados –en
particular durante el crítico periodo de la gastrulación y
morfogénesis temprana�] uno de los más comunes herbicida usados en la
agricultura
Los herbicidas del tipo del Roundup contienen glifosato en diferentes
concentraciones además de adyuvantes, detergentes que facilitan la
absorción del glifosato por la planta. Por ejemplo POEA (tallowamina
polietoxilada) (POEA como otros detergentes son utilizados para
facilitar la penetración en las plantas del glifosato, para mejorar la
eficacia de la acción del herbicida permitiendo una mayor
concentración del mismo, en las células vegetales. Todos los
detergentes o sustancias tensioactivas son tóxicos para las células
vivas porque alteran su membrana y cambian sus propiedades alterando
la actividad metabólica. Por lo cual son en general nocivos y las
células son dañadas hasta la muerte como lo mostró en distintos
cultivos celulares el grupo de J. Seralini) es uno de los más comunes
y muy toxico dado que se degrada lentamente y por lo tanto se acumula
en las células. De esta descripción se desprende que uno de los
objetivos de este trabajo fue discriminar la posible actividad toxica
de cada componente en la mezcla comercial y determinar similitudes y
diferencias entre el herbicida con sus aditivos, de la acción
glifosato puro. Las diluciones recomendadas para la fumigación por la
industria agroquímica, oscilan entre el 1 al 2% de la solución
comercial (10 a 20ml por litro) En la realidad las diluciones
empleadas actualmente están por encima de estos valores (10% o mas)
Sin embargo resulta dificultoso establecer cual es la situación real
en el modo de uso de estos herbicida debido la falta de información y
control de uso de dosis necesarias en los cultivos, no habiendo
estudios sobre la progresiva resistencia de las malezas, la largamente
cuestionada biodegradabilidad y por lo tanto inocuidad de los
componentes de los herbicidas para el medio ambiente y la salud
humana.
Antecedentes de estudios experimentales del daño celular producidos
por glifosato
Estudios en líneas celulares animales (Benachour N et al,
Arch.Environ. Contam. Toxicol., 2005 and Benachour N. and Seralini
Gilles�]Eric, Chemical Research in Toxicology, vol 22, 97�]105 enero
2009) usando marcadores enzimáticos daño de la mitocondria (succinato
dehidrogenasa) y de muerte celular programada (caspasas 3/7) mostraron
el efecto toxico en dosis inferiores 10 a 1000 veces menores a las
usadas en agricultura producidas tanto por el herbicida comercial como
por el glifosato puro.(muerte celular programada (apoptosis) es un
mecanismo de muerte celular modula en poblaciones y los procesos de
patrón de formación y construcción embrionaria la división celular,
eliminan de células que pudieren alterarse en forma no deseada,
coopera en proveer y mantener la forma de las estructuras durante el
desarrollo del embrión. La activación de las caspasas ante estímulos
programados genéticamente o externos a las células es una etapa en el
comienzo de una serie de mecanismo que conduce a la muerte celular
cuando el organismo lo requiere. Por la modificación de estas vías
moleculares son indicadores de muerte celular inadecuada y anormal)
Otra contribución reveladora realizada por el grupo de Seralini,
sostiene que diluciones del herbicida glifosato del orden 1/1000,
produce, en cultivos de células animales, destrucción de membranas y
daño mitocondrial que llevan a la destrucción celular.
Es en este punto que se hace necesario analizar el problema con
rigurosidad en relación con el posible efecto toxico de las mezclas
comerciales de los herbicidas precisando cual es la contribución del
glifosato puro en los posibles efectos que se vienen observando en los
estudios observados hasta ahora por distintos grupos nacionales y
extranjeros.
Según Seralini, el glifosato puro parece actuar en el curso de las
primeras 24 horas activando las caspasas e induciendo muerte celular
(apoptosis) en cultivos de células con dosis de 500 a 1000 veces
menores que las usadas en agricultura y 200 veces menores que las
necesarias para producir daño de membranas.
Por cierto tanto el herbicida comercial como el glifosato puro inducen
muerte celular, pero mientras el primero parece ser el resultado de
necrosis y apoptosis combinadas, el segundo por su acción a dosis muy
pequeñas podría inducir apoptosis, y que al menos en parte, podría
ejercer su efecto desde receptores de membrana celular. En otras
palabras el glifosato podría estar interfiriendo en un mecanismo,
todavía no explorado, que forma parte de la fisiología normal de las
células y eventualmente en nuestro modelo la formación de tejidos y
órganos, disparado desde receptores celulares específicos
(intracelulares o de membrana). El glifosato puro también ha llamado
la atención como interfiriendo en el mecanismo de reparación
fisiológico del DNA que podrían conducir a la acumulación de
mutaciones en algunos tipos celulares aumentando el riesgo de procesos
de malignizacion celular.
Un reporte experimental en este sentido son los experimentos en huevos
de erizo de mar que mostraron que el glifosato per se, deteriora los
puntos de control del ciclo celular asociados a la reparación del DNA,
(Marc J. y col, Res. Chem. Toxicology 2002) y el glifosato y su
principal metabolito (AMPA) alteran la transcripción en embriones de
erizo de mar (Marc J. y col, Toxicol. Appl. Pharmacol. 2005) afectando
el desarrollo embrionario.
Esos puntos de control, esenciales para la célula, parecen asociarse a
las CDK/ciclina B y su alteración induce a las células, vía el camino
de las caspasas, a la apoptosis. (Belle R. y col, J. Soc. Biol. 2007,
Le Bouffant R. y col, Cell. Mol.Life Sc. 2007).
Estudio de los efectos del glifosato
El estudio del desarrollo embrionario es ideal es para determinar la
concentración de un agroquímico como el glifosato tanto para estudiar
mecanismos fisiológicos que conduzcan a producir células cancerosas o
alteraciones durante el desarrollo como los observados en el estudio
realizado aquí.
MATERIALES METODOS Y DISEÑO EXPERIMENTAL
Concentraciones de la solución herbicidas:
La concentración estimada de glifosato del herbicida usado esta
estimada entre 500 y 600 g/l. Las diluciones para fumigar en
agricultura están establecidas entre 1% y 30%. Esto equivale a
aspersiones que van desde 6 gr/l a 200 gr/l respectivamente.
Análisis de resultados y estrategias empleadas
1. Por inmersión: los embriones como se desarrollan en medio líquido,
se sumergen en una solución salina similar a la del medio natural con
diluciones del herbicida comercial 1/5000.
2. Por microinyecció n. glifosato puro fue inyectado en una de las dos
primeras células embrionaria. (la dosis corresponde al rango detectado
por Peruzzo P. et al, Environmental Pollution, 2008, para aguas del
sistema Pergamino�]Arrecifes, Provincia de Buenos Aires y por la
Agencia Protección Ambiental en territorio estadounidense) .
3. Marcadores moleculares. El análisis de efectos en los embriones a
distintos estadios del desarrollo se hizo usando la técnica In situ
hibridizacion para detectar la expresión específicos de genes
marcadores de territorios y poblaciones celulares de la placa neural
temprana, formación eje anteroposterior embrionario, estructuras
romboencefálicas y cresta neural, etc.). El patrón formación de los
cartílagos cefálicos en renacuajos, se analizo con la tinción de
Alcian Blue.
RESULTADOS
1. Embriones del anfibio Xenopus laevis fueron incubados por inmersión
en el herbicida en
diluciones 1/5000, desde estadio de dos células hasta su análisis
experimental. La dilución
corresponde a dosis de glifosato entre 50 y 1540 veces inferior de las
usadas en el campo (tomando rango de diluciones entre el 1% a 30%
respectivamente) y 5000 veces menos de la solución comercial. Mayores
dosis matan los embriones.
2. Embriones de Xenopus laevis fueron inyectados con 5 nl de glifosato
puro en una blastomera en el estadio de dos células y dejados
desarrollar hasta diferentes estadios del desarrollo embrionario. La
dosis de glifosato inyectada en los embriones representa
aproximadamente 10000 a 300000 veces menores que las usadas en el
campo (tomando rango de diluciones entre el 1% y 30% respectivamente)
Experimentos de inmersión de herbicida,
• Disminución del largo del embrión, alteraciones que sugieren
defectos en la formación del eje embrionario.
• Alteración del tamaño de la zona cefálica con compromiso en la
formación del cerebro y reducción de ojos y alteraciones de los arcos
branquiales y placoda auditiva.
• Alteración de los mecanismos de formación de la placa neural
evidenciados por una disminución de neuronas primarias que podrían
como en otros casos observados anteriormente, afectar el normal
desarrollo del cerebro, cierre del tubo neural u otras deficiencias
del sistema nervioso.(Franco et al. Development 1999 y Paganelli et
al. MOD 2001)
Experimentos con glifosato puro,
• Alteraciones en la formación y/o especificació n de la cresta neural
craneal. (la cresta neural craneal es un conjunto de células ordenado
en un territorio adyacente a los bordes externos de la placa neural
que tienen como destino, entre otros con los arcos branquiales, la
formación de cartílagos y huesos faciales. Cualquier alteración de
forma por fallas de división celular o de muerte celular programada en
esta región conduce a malformaciones faciales serias. En el caso de
los embriones inyectados observamos una disminución de los marcadores
de este tejido embrionario compatibles con una inhibición de la
expresión de los mismos o con una disminución del número de células.
Es sugestivo que la consecuencia de lo anterior se traduzca en una
deformación de los cartílagos (condrogenesis craneal) cefálicos que
constituyen el patrón de forma de los huesos de la cara. Esto es
compatible con alteración de la muerte celular programada necesaria
para la organización de la forma y por lo tanto con malformaciones
craneales tal como fue sugerida en estudios ecotoxicologicos en anuros
por Lajmanovich y col. de la Univ. del Litoral.
• El tubo intestino muestra alteraciones en su rotación y tamaño
además de posibles alteraciones en la región cardiogenica.
DISCUSION
La acción del glifosato sobre los embriones sugiere un efecto
específico que distorsiona o altera procesos biológicos normales en
territorios y tejidos específicos. Las dosis usadas de glifosato son
bajas lo que habilita a especular que no son suficientes para dañar
membranas mitocondriales con muerte celular masiva, sino que actúan
con tiempo necesario para la activación de las caspasas (enzimas
asociadas a apoptosis) que desencadenarí an la muerte celular
programada en territorios específicos.
Los efectos observados del glifosato puro, en particular sobre cresta
neural craneal y sus derivados, que pueden ser efectivamente
compatibles con alteraciones en la regulación de la muerte celular
programada, como ha sido reportado por otros grupos de investigación y
son particularmente relevantes ya que resaltan los experimentos en
cultivo de células del grupo de Seralini en Francia y los trabajos del
grupo de la Univ. Nacional del Litoral en larvas de anfibios,
(Lajmanovich et al Bull.Enviro.Contam. Toxicology, 2003). Los
resultados de este grupo en anfibios, se compadecen con las
observaciones de nuestros experimentos embriológicos.
Por lo tanto el hecho que en los experimentos aquí presentados, tanto
el glifosato como el herbicida comercial afecten durante el desarrollo
embrionario territorios embrionarios discretos (cabeza, ojos,
intestino branquias) formados por tejidos y órganos específicos
sugieren que:
1.En cada momento del desarrollo del embrión selectos grupos celulares
parecen ser más sensibles al glifosato que otros, probablemente debido
a estados funcionales distintos (proliferació n diferenciació n o
migración celular). En algunos de ellos las células podrían presentar
más sensibilidad que otras en un momento dado y habilitar a ser
afectadas por el glifosato (por ejemplo poblaciones celulares que
están en etapas de división celular o muerte celular programada o
apoptosis).
2.En consecuencia, los efectos observados con las dosis aquí
empleadas, en ambos grupos de experimentos, no destruyen completamente
al embrión (una forma de muerte celular masiva) sino que alteran con
distintas intensidad la forma y desarrollo de territorios
morfogenéticas discretos.
3.Otro aspecto a resaltar es que concentraciones muy reducidas de
glifosato como las usadas aquí respecto de las usadas en el terreno,
producen en el embrión efectos reproducibles tanto morfológicos como
moleculares acotados. Al menos hasta donde la interpretació n de los
marcadores moleculares nos permiten.
4.Esto posibilita interpretar que el sustento de los efectos aquí
reportados producidos por el glifosato, estén asociados a la
interferencia de mecanismos normales de regulación del desarrollo
embrionario.
5.La conservación de la mecánica, regulación genética, especificació n
y determinación de territorios y poblaciones celulares durante el
desarrollo embrionario, bien establecida desde los años 80 con el
descubrimiento de los programas que conduce las morfogénesis (genes
Hox) y los avances en la interpretació n de las bases evolutivas de
los vertebrados permiten inferir desde el principio de precaución de
la ciencia medica que las alteraciones descriptas sean efectivamente
extrapolable al efecto sobre el desarrollo de cualquier vertebrado. El
principio de precaución prevalece ante cualquier sospecha de daño a la
salud pública.
Los experimentos por microinyecció n con uso posterior de marcadores
moleculares de territorios y/o poblaciones celulares con cantidades
discretas y controladas de glifosato puro en blastomeras embrionarias,
tienen la ventaja de estudiar los efectos en las etapas tempranas del
desarrollo cuando los procesos de morfogénesis están modelando el
embrión y de asociar directamente a la droga con el efecto observado,
evitando las posibles variaciones del medioambiente y la interferencia
de los otros componentes.
El enfoque estratégico no pretende ser un estudio ecotoxicológico,
sino encarar con marcadores moleculares y otras técnicas, la
investigación de los mecanismos celulares propios del desarrollo
embrionario normal, que pudieren estar involucrados su alteración.
Por lo tanto trata de independizar las observaciones experimentales de
las variaciones del medio ambiente y de las conocidas diferencias de
sensibilidad propias de las especies en su medio ambiente natural (pH,
temperatura, concentraciones variables y diferentes mecanismos de
absorción y excreción).
Andres E. Carrasco